Trừu tượng
Mục đích của công việc này là phân tích Lactamase trong Escherichia coli sản sinh IRS niệu sinh dục. Các chủng đã được thu thập trong bệnh viện của chúng tôi (2013 và 2014) từ nước tiểu của bệnh nhân nhập viện (100%). Từ tổng số 60 chủng E.coli được thu hồi trong thời gian nghiên cứu, 22 cho thấy giảm tính nhạy cảm với kháng sinh kết hợp Beta ức chế Beta Lactamase (BLBLI), với 17 trong số đó sản xuất enzyme IRT. Chúng hầu hết được phục hồi từ nước tiểu (100%). Một mức độ cao của IRT đã được phát hiện (TEM-2, CTX-M, bla-SHV, SHV-2, TEM-1, OXA-1 và AMPC). Kết quả của nghiên cứu này được ghi nhận lần đầu tiên ở Iraq.
Giới thiệu
Các enzyme IRT đại diện cho một cơ chế kháng thuốc thích nghi được vi khuẩn đặc biệt phát triển để khắc phục hoạt động của các chất ức chế? -Lactamase [1]. Kháng với sự kết hợp của thuốc ức chế men -lactam -? và / hoặc porp OmpC, TEM kháng IR (IRT) – và sản xuất đột biến phức tạp giống như TEM (CMT), giống như sản xuất carbapenemase [2]. Các enzyme IRT bao gồm một nhóm các biến thể mã hóa plasmid của TEM-1 và TEM-2 với sự giảm ái lực với amino-, carboxy- và ureidopenicillins và thay đổi tương tác với các chất ức chế nhóm A? -Lactamase [3]. Các phân lập sản xuất IRT vẫn mẫn cảm với cephalosporin, cephamycins, carbapenems và trong hầu hết các trường hợp, piperacillin-tazobactam.
Chúng thường kháng với ampicillin-sulbactam và trung gian hoặc kháng với các phối hợp amoxicillin-clavulanate. Các enzyme IRT trước đây đã được báo cáo ở các sinh vật khác nhau, chẳng hạn như E. coli, Klebsiella spp., Enterobacter cloacae, Proteus mirabilis, Citrobacter freundii và Shigella sonnei [2]. Nhưng chỉ có một vài nghiên cứu dịch tễ học gần đây liên quan đến các enzyme này. Hơn nữa, cấu trúc dân số của các chủng E. coli sản xuất IRT đã không được giải quyết bằng cách sử dụng kỹ thuật gõ chuỗi đa điểm (MLST). Ban đầu chúng được đặt tên là TRC (enzyme TEM kháng axit clavulanic) [4], và sau đó là TRI (TEM kháng với thuốc ức chế? -Lactamase) [5], và cuối cùng được đặt tên là IRT [6].
Nguyên liệu và phương pháp
Thiết kế nghiên cứu:
Khi bắt đầu nghiên cứu này, 100 mẫu nước tiểu được thu thập từ các bệnh nhân bị nhiễm khuẩn đáng kể trong khoảng thời gian từ tháng 11 năm 2013 đến cuối tháng 1 năm 2014 từ ba bệnh viện chính ở thành phố hilla / iraq (bệnh viện giảng dạy hilla, thời thơ ấu và phụ khoa bệnh viện và bệnh viện đa khoa al-hashimiyeh, ngoài một số phòng khám tư nhân, mỗi mẫu được cấy ngay lập tức trên đĩa thạch macconkey và thạch agar. Tăm bông đã được tiêm trên môi trường nuôi cấy và ủ trong suốt 24 giờ ở 37 giờ. về tuổi tác, nơi cư trú, việc sử dụng kháng sinh, và nhập viện của bệnh nhân đã được đưa vào xem xét.
Phân lập vi khuẩn
Niệu sinh e. các phân lập coli đã được phục hồi và xác định dựa trên hình thái, nhuộm gram, xét nghiệm indole, xét nghiệm mr-vp và kiểm tra vận động [7]. xác định đã được xác nhận bằng cách sử dụng gen rrna 16s cụ thể bằng xét nghiệm pcr.
Xét nghiệm độ nhạy cảm với kháng sinh:
Mô hình mẫn cảm kháng khuẩn của các chủng phân lập với các kháng sinh khác nhau được xác định bằng cách sử dụng xét nghiệm khuếch tán đĩa và được giải thích theo hướng dẫn của clsi [8]. các loại kháng sinh sau đây được lấy (từ oxoid, uk, và bioanalyse, gà tây) dưới dạng đĩa tham chiếu tiêu chuẩn như tiềm năng đã biết để sử dụng trong phòng thí nghiệm: ampicillin, am (10? g) amoxillin, ax (25? g), amoxillin / clavulanic acid, amc (30 Patrick) Sự kết hợp, ceftizoxime, czx (30 (10 Phag), aztreonam atm (30 Phag), gentamicin cn (10 Phag), axit nalidixic na (30 Đánh giá), ciprofloxacin cip (30 Muffg), tetracycline te (30 Muffg).
Xét nghiệm sàng lọc đối với
Ampicillin và amoxicillin kháng b-lactam đã được thêm vào, riêng biệt, từ dung dịch gốc đến môi trường thạch muller-hinton được làm lạnh ở nồng độ cuối cùng lần lượt là 100 và 50 Miếng / ml. môi trường được đổ vào đĩa petri tiệt trùng, sau đó được bảo quản ở 4? c. sàng lọc sơ bộ của e. coli phân lập kháng cả hai loại kháng sinh được thực hiện bằng phương pháp lấy và vá trên các tấm trên [9]. kết quả được so sánh với e. coli atcc 25922 làm đối chứng âm và e. coli atcc 35218 như một sự kiểm soát tích cực.
Phát hiện ?? – sản xuất lactamase:
Đĩa chẩn đoán nitrocefin (fluka, switzerland) đã được sử dụng để phát hiện khả năng của 15 phân lập để sản xuất ?? – lactamase. một số đĩa nitrocefin cần thiết được đặt vào đĩa petri vô trùng và được làm ẩm bằng một giọt dw vô trùng sau đó đĩa được kẹp bằng kẹp vô trùng và quét qua một khuẩn lạc trẻ trên đĩa thạch. sự phát triển của màu đỏ trong khu vực của đĩa nơi nuôi cấy được áp dụng cho thấy kết quả dương tính.
Xác định mics của e. coli phân lập:
Phương pháp mẫn cảm pha loãng agar hai lần đã được sử dụng để xác định mics của kháng sinh? -lactam theo clsi [8].
Sàng lọc ban đầu ampc b-lactamase
Tất cả các phân lập kháng b-lactam đã được kiểm tra độ mẫn cảm với cefoxitin bằng phương pháp khuếch tán đĩa tiêu chuẩn [8]. các phân lập kháng (đường kính vùng ức chế £ 18mm) được xem là các nhà sản xuất b-lactamase ban đầu.
Sàng lọc ban đầu để sản xuất esbl:
Tất cả các chủng vi khuẩn được sản xuất b-lactamase đã được kiểm tra để sản xuất esbl bằng thử nghiệm sàng lọc ban đầu. phân lập sẽ được coi là nhà sản xuất esbl tiềm năng, nếu vùng ức chế của đĩa ceftazidime (30 Pha) là £ 22 mm [8].
Kiểm tra xác nhận cho sản xuất esbl
Tất cả các phân lập sản xuất b-lactamase cũng đã được thử nghiệm để sản xuất esbl xác nhận bằng thử nghiệm kết hợp đĩa (được khuyến nghị bởi clsi, 2014) [8] như sau: chỉ dùng cefotaxime và kết hợp với axit clavulanic. Vùng ức chế tăng increase 5 mm đường kính đối với kháng sinh được thử nghiệm kết hợp với axit clavulanic so với vùng của nó khi thử nghiệm một mình xác nhận một chủng sản xuất esbl.
Chiết xuất và tinh chế plasmid dna:
Một nhóm vi khuẩn được nuôi cấy, được ủ qua đêm, chuyển vào 2 ml nước canh dinh dưỡng vô trùng và ủ ở 37? c trong 18-20 giờ.
Bộ dụng cụ chuẩn bị khai thác dna (solgent, korea) theo hướng dẫn sản xuất (solgent, korea). plasmid dna đã được sử dụng để phát hiện tem-1, tem-2, shv, shv-2, oxa-1, oxa-2, oxa-10, ampc và ctx-m.
Chuẩn bị huyền phù mồi:
Các mồi dna (bảng 1) được nối lại bằng cách hòa tan sản phẩm đông khô sau khi quay xuống một cách nhanh chóng với te đệm phân tử tùy thuộc vào chỉ dẫn của nhà sản xuất như huyền phù cổ phiếu. ống mồi làm việc được chuẩn bị bằng cách pha loãng với chất đệm phân tử te. các picomoles cuối cùng phụ thuộc vào quy trình của từng mồi.
Điều kiện nhiệt độ pcr monoplex:
Các ống pcr được đặt trên máy pcr và các điều kiện tham số chương trình chu trình pcr bên phải đã được cài đặt như trong bảng-2.
Điện di gel agarose:
các sản phẩm pcr khuếch đại được phát hiện bằng điện di gel agarose được hình dung bằng cách nhuộm với ethidium bromide. kết quả điện di được phát hiện bằng cách sử dụng hệ thống tài liệu gel biometra.
Các kết quả
Phân lập và xác định các chủng phân lập:
Trong số 100 mẫu nước tiểu, 90 (90%) cho thấy sự phát triển nuôi cấy dương tính và thu được 90 phân lập vi khuẩn. 60 (60%) được phát hiện là E.
Coli gây bệnh tiết niệu Tần số của vi khuẩn E. coli gây bệnh u-lactam:
Tần số kháng? -Lactam được đánh giá khi các chủng chủ yếu sàng lọc kháng với ampicillin và amoxicillin [10, 11 ]. Kết quả thu được trong nghiên cứu này cho thấy 33 (55%) phân lập E. coli kháng cả ampicillin và amoxicillin.
Nhạy cảm với kháng sinh của E. coli:
Sắp xếp các loại kháng sinh đã được sử dụng để điều trị UTI do E. coli ở Iraq và các quốc gia khác. Tuy nhiên, việc sử dụng rộng rãi phương pháp này đã chỉ trích trên cơ sở độc tính của thuốc và nguy cơ tăng kháng kháng sinh lan truyền [24]. Nhạy cảm với kháng sinh của tất cả 22 chủng E.coli phân lập được với 20 loại kháng sinh cho thấy tình trạng kháng đa kháng thuốc. Hiện nay tình trạng kháng vi khuẩn đối với kháng sinh đang lan rộng và sở hữu các mối đe dọa lâm sàng nghiêm trọng. Tần số kháng kháng sinh của 22 chủng E.coli phân lập kháng với một hoặc nhiều BLBL đã được xác định. Tất cả các chủng phân lập này (100%) đã được tìm thấy có khả năng kháng ampicillin và amoxicillin.
Tính mẫn cảm của 22 chủng E.coli phân lập với 20 loại kháng sinh được lựa chọn đã được nghiên cứu. Các kết quả trong hình 1 thể hiện hồ sơ kháng sinh của các chủng phân lập và chỉ ra rằng các chủng phân lập khác nhau về tính mẫn cảm với kháng sinh. Tất cả các chủng phân lập đều kháng cao (100%) với ampicillin và amoxicillin. Ngoài ra, kết quả trong hình này cho thấy tất cả 22 chủng phân lập đều nhạy cảm với cefoxitin (100%). Nó đã được tìm thấy rằng 81,8% của các chủng đã kháng với cephalexin, cephatholin và aztreonam.
Tỷ lệ kháng với cephalosporin thế hệ thứ ba như sau:
77,2% cefazolin, ceftraxone và ceftazidime. Ngoài ra, 22,7% các chủng phân lập biểu hiện tính kháng với cephalosporin thế hệ thứ tư, cefepime. Tỷ lệ kháng thấp nhất được tìm thấy so với carbapenems. Kháng kháng sinh carbapeneme (đại diện bởi imipenem, ertapenem và meropenem) là 0 (0%), cũng là tỷ lệ thấp nhất cho thấy trong kháng sinh Nitrofurantoin là 0 (0%). Tỷ lệ kháng với aminoglycoside thấp, gentamicin được phát hiện 45,4%. Các quinolone hoạt động mạnh nhất chống lại tất cả các vi khuẩn E. coli được thử nghiệm là levofloxacin, trong đó các chủng phân lập có tỷ lệ kháng 27,2% sau đó là ciprofloxacin có tỷ lệ kháng 31,8% và axit nalidixic 63,6%.
Tỷ lệ kháng kháng sinh còn lại:
Tetracycline 68,1% trimethoprim-sulfamethoxazole 77,2% và tobramycin 22,7%. Suman và cộng sự [25] đã báo cáo rằng 54% các chủng phân lập được nhạy cảm với gentamicin, sau đó là tobramycin (50%), co-trimoxazole (44%) và ciprofloxacin (44%), trong khi đó trong nghiên cứu hiện tại, E. coli phân lập ít nhạy cảm với các kháng sinh được thử nghiệm. Supriya et al [26] đã báo cáo rằng 82 và 79,6% E. coli kháng với co-trimoxazole và ampicillin. Kết quả tương tự đã được quan sát trong nghiên cứu hiện tại cho thấy sự kháng thuốc tối đa đối với các loại thuốc này. E. coli với integron có nhiều khả năng biểu hiện MDR thành gentamicin, ampicillin, tetracycline và axit nalidixic [27].
Trong nghiên cứu
Người ta đã phát hiện ra rằng một số chủng vi khuẩn E. coli đã kháng hơn sáu loại kháng sinh, điều đó có nghĩa là cần phải lựa chọn kháng sinh thay thế để loại trừ vi khuẩn E. coli liên quan đến nhiễm trùng đường tiết niệu. E. coli là nguyên nhân phổ biến nhất của UTI biểu hiện kháng kháng sinh cao trong số các chủng. Vì vậy điều này chắc chắn rằng cần phải sử dụng kháng sinh hợp lý. Trong UTI mãn tính, một E. coli phát triển chậm với hình thái khuẩn lạc không điển hình và chủng MDR đã được báo cáo bởi [28].
Penicillins, chẳng hạn như ampicillin và amoxicillin, trước đây được sử dụng làm liệu pháp điều trị tiền căn cho UTI. Sự đề kháng với các tác nhân này được trung gian bởi? -Lactamase làm suy giảm chúng, và các enzyme này đóng vai trò quan trọng trong UTI kháng kháng sinh [29].
Kết quả trong nghiên cứu
này cũng tương tự với kết quả của Aiyegor et al. [24] người phát hiện ra rằng E. coli là mầm bệnh chính được phân lập từ những bệnh nhân bị nhiễm khuẩn niệu đáng kể, cho thấy khả năng kháng amoxicillin và ampecillin cao. Các nghiên cứu khác từ các quốc gia khác đã báo cáo sự gia tăng sức đề kháng ở các chủng E. coli đối với ampecillin [30].
Xác định MIC của các chủng vi khuẩn sản xuất IR:
Kết quả xác định MIC của các chủng E.coli sản xuất IR cho thấy tất cả 22 chủng phân lập đều có khả năng kháng ampicillin cao với nồng độ vượt quá giá trị điểm dừng. Giá trị MIC của ampicillin là 32ug / ml tương ứng (100%). Các kết quả được trình bày trong bảng 12 đánh giá rằng MIC của ceftazidime nằm trong khoảng từ 1 đến 64 Giảm / ml; 17% phân lập tính kháng với ceftazidime, chỉ có 5 chủng phân lập có giá trị MIC tối thiểu 1 Phag / ml; 4 trong số này có ESBL âm và 1 có ESBL dương.
Các kết quả được trình bày trong bảng -4 đánh giá rằng MIC của ceftriaxone nằm trong khoảng từ 1 đến 64 Phag / ml, 77% phân lập tính kháng với ceftriaxone cũng chỉ có 5 chủng với giá trị MIC tối thiểu 1 1gg / ml.
Cũng đánh giá MIC của cefazolin trong khoảng từ 1 đến 64 Laug / ml chỉ có 3 chủng phân lập với giá trị MIC tối thiểu 4, 86% phân lập tính kháng với cefazolin; mặt khác, các chủng phân lập có MIC của ampicillin-sulbactam nằm trong khoảng từ 8 đến 32 Phag / ml chỉ với một giá trị MIC tối thiểu 8 giậtg / ml. 86% kháng với ampicillin-sulbactam; cũng có MIC của pipracillin-tazobactam trong khoảng từ 4 đến 128 chỉ với 4 (18%) giá trị MIC tối đa 128 Súngg / ml; và cuối cùng các dòng phân lập có MIC cho amoxcillin-clavulanis có phạm vi từ 4 đến 32, chỉ có một loại có giá trị tối thiểu 4 xăngg / ml, 32% kháng với amoxcillin-clavulanis.
Kết quả của nghiên cứu này
Chỉ ra rằng chỉ có 5 phân lập trong bảng 4 là kháng hoặc trung gian với một hoặc nhiều phối hợp BLBLI và cho thấy nhạy cảm với cephalosporin nên những phân lập này có thể có một hoặc nhiều enzyme IR như (TEM, SHV, OXA, CTX-M và AMPC); Mặt khác, 17 phân lập khác trong bảng này có kết quả dương tính với ESBL có thể có một hoặc nhiều IR bị đột biến để biểu hiện ESBL như (TEM-1, TEM-2, SHV-1 và CTX-M). Ampicillin AM, ampicillin-sulbactam SAM, amoxicillin-clavulanic acid AMC, pipracillin-tazobactam TZP, ceftazidime CAZ, ceftriaxone CRO và cefazolin CZ MIC của 22 chủng E.coli được thiết lập theo tiêu chuẩn của viện lâm sàng và phòng thí nghiệm [8] bằng phương pháp pha loãng agar tiêu chuẩn trên môi trường Muller-Hinton có chứa kháng sinh và hệ thống nén Vitek2.
Kaye [15] cho thấy bằng xét nghiệm pha loãng agar, 67 phân lập E. coli không mẫn cảm (kháng 39 và trung gian 28) với amoxicillin-clavulanate và 37 kháng piperacillin-tazobactam nhưng chỉ có 8 kháng ceftazidime (ceftazidime) ml). Hai phân lập đã nhạy cảm với axit amoxicillin-clavulanic bằng cách pha loãng agar, mặc dù chúng kháng với xét nghiệm khuếch tán đĩa. Sàng lọc phân tử cho kỹ thuật PCR enzyme IR đã được sử dụng để sàng lọc và phát hiện các gen IR mang mồi plasmid.
Kết luận
N/a
Tác giả: Aliaa Z. AL-Tememy, Alaa H. Al-Charrakh
>>> Tham khảo bài viết hoàn chỉnh: Escherichia coli
